重组蛋白A/G琼脂糖珠（Recombinant Protein A/G Sepharose）
产品编号：
NCTP58765
品牌：
NCT
规格：
说明书：
产品介绍
天然蛋白A（Protein A）和天然蛋白G（Protein G）是分别发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面蛋白和从G型或C型链球菌属分离出的细胞表面蛋白。两者均能通过与免疫球蛋白（Ig）的Fc区相互作用，结合大多数哺乳动物的IgG，用于免疫沉淀（IP）、免疫共沉淀（Co-IP）以及多种抗体（单抗、多抗）的分离纯化过程。
本产品则使用了基因改造后的Protein A和Protein G，在维持了其Ig亲和特性外，同时去除了天然蛋白的非主要结合域，降低了非特异性的结合。然后，将重组蛋白A/G共价偶联到琼脂糖凝胶微球表面使其具有更广泛的结合范围。Protein A和Protein G两者结合特异性上有所不同，Protein G结合人IgG3以及大鼠IgG2a的能力较Protein A强，但不与鸡或猫 IgG 或者人 IgA、IgM结合（具体见附件1）。本产品对蛋白A和蛋白G单独具有结合特性的不同的免疫球蛋白亚类均适用。
产品组成
产品用法
一. 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）
方式一
1. 利用RIPA buffer裂解细胞或组织，裂解物终总蛋白浓度控制在最佳范围。
2. 取两个无菌离心管，标记为实验组及对照组。实验组中加入200-400μL体积总蛋白裂解物（质量约1-3mg）、150-300μL孵育buffer以及1-4μg特异性抗体。对照组加入相同质量体积的蛋白裂解物、等体积的孵育buffer以及相同种属的等量IgG。4℃旋转过夜。
3. 每管中分别加入80-100μL充分重悬的 Protein A/G beads（蛋白A/G琼脂糖珠需要用PBS低速离心洗涤3次），4℃ 旋转孵育1-4h。
4. 用含蛋白酶抑制剂的1×Washing buffer洗涤沉淀复合物，4℃ 500g离心30S，吸净上清，重复此步骤5次。
5. 加入80μL Washing buffer 和 20μL 5 × Sample Buffer，重悬琼脂糖珠，沸水浴煮5 min。
6. 8000g-10000g离心3 min，小心将上清吸入新EP管中。取20-40μL样品进行SDS-PAGE电泳检测。设置Control IgG对照和Input对照。
方式二（酸洗法）
1. 利用RIPA buffer裂解细胞或组织，取两个下端带有堵帽的纯化柱，标记为实验组及对照组。实验组中加入200-400μL体积总蛋白裂解物（质量约1-3mg）、150-300μL孵育buffer以及1-4μg特异性抗体。对照组加入相同质量体积的蛋白裂解物、等体积的孵育buffer以及相同种属的等量IgG。4℃旋转过夜
2. 向每纯化柱中分别加入80-100μL充分重悬的 ProteinA/G beads（蛋白A/G琼脂糖珠需要用PBS低速离心洗涤3次），4℃ 旋转孵育1-4h。
3. 弃除上清液，用含蛋白酶抑制剂的1 x Washing buffer洗涤沉淀复合物5次。洗涤完成后将纯化柱置于收集管中，4℃ 500g 30s，离心后收集管中液体。
4. 将纯化柱置入新的离心管中，用40μL洗脱液洗脱沉淀复合物，室温静置5-10min，4℃ 8000-10000g离心1min，再用40μL洗脱液以同样的方法洗脱一次，将两次洗脱液混合在一起。
5. 向洗脱液中加入10μL 碱中和液和23μL 5 x Sample Buffer，沸水浴加热5min。
6. 取20-40μL样品进行SDS-PAGE电泳检测，设置Control IgG对照和Input对照。
二、免疫共沉淀 （Co-IP）
参考1中免疫沉淀的方法进行，免疫共沉淀需提供未经冻存的新鲜细胞或组织蛋白裂解物。
三、抗体纯化
1. 根据抗体的亚型确定填料的种类。
2. 充分摇匀本产品后取出相应体积的填料，用30倍体积的PBS洗涤填料，以去除保存液。
3. 初级原料需要清澄均匀，可用0.2μm滤膜过滤去除不溶成份，或者10000g离心10min。动物腹水或者抗血清，可用PBS稀释2-3倍以降低非特异性的结合。
4. 将待纯化的初级原料与填料置于旋转仪上，室温旋转2-4h或者4℃过夜。1000g 5-10min分离填料和上清。或者将填料装入层析柱，使用纯化仪或者蠕动泵将待纯化的初级原料反复流经层析柱，室温进行2-4h或者4℃过夜。结束后放出管路和流穿液。
5. 用30倍体积的PBS洗涤填料，以去除非特异性结合或者未结合的杂质。
6. 将填料转移至层析柱中，层析柱高度应保持在1-5cm。用PH 2.0-2.5 0.2M甘氨酸或者PH 2.0-2.5 HCl+150mM NaCl洗脱液洗脱。
7. 将洗脱下来的抗体立即用1M Tris或饱和磷酸氢二钠中和。中和后可能部分抗体在其等电点处而形成沉淀，此时可将PH值调至8.0左右使之溶解。少量分装后将抗体保存至-80℃或者加入甘油和防腐剂后置于-20℃保存。
8. 将纯化后的填料用30倍体积的酸碱交替洗涤填料后，用PBS洗涤至中性，4℃保存于20%乙醇中。
注意事项
1. 请勿冻存本产品
2. 每次使用前，请充分混匀琼脂糖珠
3. 所有操作均在4℃或者冰上操作
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作
5. 本试剂仅作科研用途
发表文章
联系方式
全国服务热线：022-66211462 转8001
市场部：15522207257（吴经理）
邮箱：info@saierbio.com
orders.oversea@saierbio.com
地址：天津市津南区小站镇黄台工业园嘉园道8号
天津402永利集团技术有限公司
402永利集团公众号
