重组蛋白G琼脂糖珠（Recombinant Protein G Sepharose）
产品编号：
NCTP58772
品牌：
NCT
规格：
说明书：
产品介绍
天然蛋白G（Protein G）是G型或C型链球菌属的细胞表面蛋白，与金黄色葡萄球菌细胞壁A蛋白相同，均可结合免疫球蛋白（Ig）的Fc区，用于抗体的分离纯化。但Protein G 结合的抗体亚型种类强度与Protein A 部分不同，Protein G结合人IgG3以及大鼠IgG2a的能力较Protein A强，但Protein G 不与鸡或猫 IgG 或者人 IgA、IgM结合（具体见附件1）。
本产品则使用了基因改造后的蛋白G偶联至环氧活化的琼脂糖凝胶4FF上，在维持了其Ig亲和特性外，同时去除了白蛋白的结合区域，显著降低了非特异性的结合。因其不同种属及亚型IgG亲和的广谱性、高Fc结合活性、高稳定性等特点，可从血清、腹水、细胞培养物上清等中分离纯化多种抗体亚型以及含抗体Fc区的重组蛋白。同样，也可用于免疫沉淀（IP）、免疫共沉淀（Co-IP）等实验。
产品组成
产品用法
一. 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）
方式一
1. 利用RIPA buffer裂解细胞或组织，裂解物终总蛋白浓度控制在最佳范围。
2. 取两个无菌离心管，标记为实验组及对照组。实验组中加入200-400μL体积总蛋白裂解物（质量约1-3mg）、150-300μL孵育buffer以及1-4μg特异性抗体。对照组加入相同质量体积的蛋白裂解物、等体积的孵育buffer以及相同种属的等量IgG。4℃旋转过夜。
3. 每管中分别加入80-100μL充分重悬的 Protein G beads（蛋白G琼脂糖珠需要用PBS低速离心洗涤3次），4℃ 旋转孵育1-4h。
4. 用含蛋白酶抑制剂的1×Washing buffer洗涤沉淀复合物，4℃ 500g离心30S，吸净上清，重复此步骤5次。
5. 加入80μL Washing buffer 和 20μL 5 × Sample Buffer，重悬琼脂糖珠，沸水浴煮5 min。
6. 8000g-10000 g离心3 min，小心将上清吸入新EP管中。取20-40μL样品进行SDS-PAGE电泳检测。设置Control IgG对照和Input对照。
方式二（酸洗法）
1. 利用RIPA buffer裂解细胞或组织，取两个下端带有堵帽的纯化柱，标记为实验组及对照组。实验组中加入200-400μL体积总蛋白裂解物（质量约1-3mg）、150-300μL孵育buffer以及1-4μg特异性抗体。对照组加入相同质量体积的蛋白裂解物、等体积的孵育buffer以及相同种属的等量IgG。4℃旋转过夜
2. 向每纯化柱中分别加入80-100μL充分重悬的 Protein G beads（蛋白G琼脂糖珠需要用PBS低速离心洗涤3次），4℃ 旋转孵育1-4h。
3. 弃除上清液，用含蛋白酶抑制剂的1 x Washing buffer洗涤沉淀复合物5次。洗涤完成后将纯化柱置于收集管中，4℃ 500g 30s，离心后收集管中液体。
4. 将纯化柱置入新的离心管中，用40μL洗脱液洗脱沉淀复合物，室温静置5-10 min，4℃ 8000-10000g离心1 min，再用40μL洗脱液以同样的方法洗脱一次，将两次洗脱液混合在一起。
5. 向洗脱液中加入10μL 碱中和液和23μL 5 x Sample Buffer，沸水浴加热5min。
6. 取20-40μL样品进行SDS-PAGE电泳检测，设置Control IgG对照和Input对照。
二、免疫共沉淀 （Co-IP）
参考1中免疫沉淀的方法进行，免疫共沉淀需提供未经冻存的新鲜细胞或组织蛋白裂解物。
三、抗体纯化
1. 根据抗体的亚型确定填料的种类。
2. 充分摇匀本产品后取出相应体积的填料，用30倍体积的PBS洗涤填料，以去除保存液。
3. 初级原料需要清澄均匀，可用0.2μm滤膜过滤去除不溶成份，或者10000g离心10min。动物腹水或者抗血清，可用PBS稀释2-3倍以降低非特异性的结合。
4. 将待纯化的初级原料与填料置于旋转仪上，室温旋转2-4h或者4℃过夜。1000g 5-10min分离填料和上清。或者将填料装入层析柱，使用纯化仪或者蠕动泵将待纯化的初级原料反复流经层析柱，室温进行2-4h或者4℃过夜。结束后放出管路和流穿液。
5. 用30倍体积的PBS洗涤填料，以去除非特异性结合或者未结合的杂质。
6. 将填料转移至层析柱中，层析柱高度应保持在1-5cm。用PH 2.0-2.5 0.2M甘氨酸或者PH 2.0-2.5 HCl+150mM NaCl洗脱液洗脱。
7. 将洗脱下来的抗体立即用1M Tris或饱和磷酸氢二钠中和。中和后可能部分抗体在其等电点处而形成沉淀，此时可将PH值调至8.0左右使之溶解。少量分装后将抗体保存至-80℃或者加入甘油和防腐剂后置于-20℃保存。
8. 将纯化后的填料用30倍体积的酸碱交替洗涤填料后，用PBS洗涤至中性，4℃保存于20%乙醇中。
注意事项
1. 请勿冻存本产品
2. 每次使用前，请充分混匀琼脂糖珠
3. 所有操作均在4℃或者冰上操作
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作
5. 本试剂仅作科研用途
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